Coordenação: Claucia Fernanda Volken de Souza
Pesquisadores:A indústria de leite e derivados tem produção expressiva no Brasil, especialmente no Rio Grande do Sul, um dos estados de maior produção do país, contribuindo para a expansão e diversificação econômica. No Vale do Taquari, região central do Rio Grande do Sul, este setor também se destaca pelo volume produzido e processado pelas diversas indústrias de beneficiamento instaladas na região. Entretanto, tal volume de produção resulta na geração de quantidade expressiva de subprodutos e resíduos, os quais são fontes de poluição de solos e recursos hídricos caso não sejam tratados de forma adequada. Assim, o objetivo desse projeto é estabelecer processos biotecnológicos que visem ao desenvolvimento de tecnologias de aproveitamento dos subprodutos e resíduos gerados pela indústria de laticínios e ao incremento da qualidade dos produtos. Para isso, serão desenvolvidos processos visando: empregar os soros lácteos como meios de cultivo, a fim de gerar bioprodutos de valor agregado; utilizar os resíduos e os subprodutos gerados pelos laticínios como matérias-primas para a elaboração de produtos lácteos fermentados; desenvolver bioprocessos para produção e imobilização de β-galactosidases recombinantes; utilizar os soros lácteos como materiais de parede no microencapsulamento de ingredientes bioativos; e produzir e caracterizar hidrolisados proteicos e peptídeos bioativos obtidos a partir da hidrólise enzimática dos soros lácteos. As metodologias de planejamento experimental e análise de superfície de resposta serão empregadas para otimização das condições dos bioprocessos, maximizando rendimentos, produtividade e viabilidade comercial; minimizando custos e conduzindo à obtenção de bioprodutos com as especificações desejadas. Além disso, através do uso das técnicas instrumentais e de biologia molecular pretende-se avaliar as características químicas, microbiológicas e bioquímicas das matérias-primas utilizadas, bem como dos bioprodutos obtidos. Como parte dos resultados espera-se desenvolver novos processos e produtos biotecnológicos de valor agregado, trazendo potenciais benefícios socioeconômicos através do desenvolvimento de tecnologias inovadoras e contribuindo para o desenvolvimento sustentável da região.
Sub projetosA enzima β-galactosidase vem sendo cada vez mais empregada na indústria de laticínios no desenvolvimento de produtos lácteos com baixos teores de lactose. Entretanto, apesar de apresentarem excelentes perspectivas, estes biocatalisadores geralmente possuem altos custos o que limita sua aplicação nos processos industriais. Dentre as alternativas para superar essa dificuldade estão, o aumento da atividade enzimática, a produção da enzima recombinante, a obtenção de células microbianas mais produtivas e a imobilização destas proteínas. Uma técnica de clonagem cada vez mais utilizada na engenharia genética é a inclusão de marcadores de afinidade do gene que codifica para a proteína alvo, os quais permitem a purificação e a imobilização da proteína em apenas uma etapa. A afinidade bioespecífica do domínio de ligação à celulose (Cellulose Binding Domain - CBD) apresenta como vantagens o uso da celulose como suporte de imobilização, que é um material abundante, barato e com excelentes propriedades químicas e físicas, e a não necessidade de agentes ligantes no processo de imobilização, pois o CBD liga-se a celulose espontaneamente, evitando o uso de possíveis compostos tóxicos. Nesse contexto, o objetivo desse projeto é produzir a enzima β-galactosidase recombinante de Kluyveromyces spp. e imobilizar em celulose magnética, visando aplicação industrial. O gene da β-galactosidase previamente extraído da cepa Kluyveromyces spp. será amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando a enzima Pfu DNA Polimerase e oligonucleotídeos iniciadores específicos, contendo os sítios de restrição SalI e XhoI. O gene amplificado será clonado em vetor de clonagem (pCR®-Blunt) e subclonado em vetor de expressão (pET-35b(+)). As cepas de Escherichia coli: BL21(DE3), Rosetta(DE3) e C41(DE3) serão transformadas com o DNA da construção pET-35b(+):β-galactosidase. As células serão crescidas em incubadora com agitação orbital (shaker) para avaliação dos seguintes parâmetros na expressão da β-galactosidase: meios de cultura, temperaturas de cultivo e indutores [isopropiltiogalactosídeo (IPTG) e lactose] em diferentes concentrações. A partir dos resultados obtidos, a melhor cepa de expressão e condição de produção serão utilizadas para produção da enzima em cultivos descontínuos alimentados em biorreator de tanque agitado de 2 L, avaliando diferentes estratégias de alimentação e agentes indutores de baixo custo, tais como soro de queijo e permeado de soro. A enzima produzida será purificada e imobilizada em uma única etapa via CBD utilizando celulose como suporte. Para a etapa de imobilização será avaliada a celulose nanocristalina e a microcristalina, ambas na forma magnética. Este processo será conduzido avaliando o uso de diferentes pHs, temperaturas e tempos de imobilização. A partir disso, espera-se desenvolver um processo biotecnológico para produção em escala piloto da β-galactosidase recombinante de Kluyveromyces spp..
O projeto visa o desenvolvimento de biotecnologias para a produção, imobilização, e aplicação de uma β-galactosidase recombinante, visando à geração de bioprocessos de larga escala. Além de aprimorar e ampliar o escopo de bioprodução e caracterização da enzima, uma vez que (a) processos de cultivo em batelada alimentada no biorreator serão aplicados na produção da β-galactosidase recombinante, além do processo em batelada; (b) o resíduo soro de ricota gerado pelas indústrias de laticínios será avaliado como indutor da enzima, além do soro de queijo e do permeado de soro; (c) variações dos parâmetros operacionais de imobilização da β-galactosidase em nanocelulose magnética serão avaliados visando otimizar o processo de purificação e imobilização em uma única etapa por meio do marcador de afinidade (tag ou cauda de ligação) a celulose; (d) a enzima imobilizada será submetida a diversas caracterizações, tais como, condições ótimas de pH e temperatura para atuação, determinação dos parâmetros cinéticos de atividade enzimática, estabilidade térmica em diferentes temperaturas e condições ótimas de armazenamento, com vistas a definir os parâmetros de processo de aplicação da enzima β-galactosidase recombinante. Ademais, será avaliada a viabilidade de aplicação da β-galactosidase imobilizada na nanocelulose magnética em processos contínuos em reator de coluna de leito fixo, determinando a capacidade de hidrólise da lactose presente no leite, soro de queijo, permeado de soro e solução de lactose. A partir desse trabalho pretende-se propor uma estratégia de produção e imobilização da β galactosidase recombinante visando sua aplicação em processos industriais sustentáveis e utilizando insumos de baixo custo, apresentando perspectivas de purificação e aplicação na hidrólise da lactose de leite e derivados.